蛙类坐骨神经–腓肠肌标本制备、不同频率刺激对肌肉收缩的影响
一．目的要求
1. 掌握蛙类双毁髓的试验方法；
2. 掌握坐骨神经—腓肠肌标本标本的制作方法；
3. 观察不同刺激频率对骨骼肌收缩形式的影响。
二．基本原理
蛙类动物的某些基本活动，如神经的生物电活动、肌肉收缩等与哺乳动物相似。其离体组时所需的生活条件比较简单，易于控制和掌握，而且动物来源丰富，因此在生理实验中常用蛙类的坐骨神经—腓肠肌标本和坐骨神经标本来观察组织的兴奋性、刺激与反应的规律以及骨骼肌收缩的特点等。肌肉受到一次阈上刺激而产生的一次收缩为单收缩，其过程可分为三个时相，即潜伏期、缩短期和舒张期。肌肉受到连续的阈上刺激时，如果刺激间隔小于单收缩的过程，相邻两单收缩的时相会出现融合，表现为强直收缩现象。如果表现为每次收缩的开始发生在上次收缩的缩短期，称完全强直收缩，如果表现为每次收缩的开始发生在上次收缩的舒张期，称不完全强直收缩。使用生物信号采集处理系统，可以观察到腓肠肌收缩的情况。
三．实验材料
实验动物：健康青蛙一只；
实验器材和药品：蛙类手术器械一套（粗剪刀一把，组织剪一把，眼科剪一把，镊子一把，探针一根、玻璃分针2把，蛙钉4个、培养皿一个，蛙板一个、滴管一个、棉线若干），张力换能器，肌槽，刺激电极，铁架台，生物信号采集处理系统，微机，任氏剂。
四．实验步骤
捣毁蟾蜍脑脊髓：取蟾蜍一只，用自来水冲洗干净。左手握蛙，用食指下压头部前端，拇指按压背部，使头前俯。中指与无名指夹其前肢，无名指与小指夹其后肢，使整个躯干做最大屈曲。把探针自枕骨大孔处垂直刺入，到达椎管，即将探针改变方向刺入颅腔，向各侧不断搅动，彻底捣毁脑组织；再将探针原路退出，刺向尾侧，捻动探针使其逐渐刺入整个椎管内，完全彻底捣毁脊髓。脊髓破坏完全的标志是：下颌呼吸运动消失，反射消失，四肢松软。
剪除躯干上部和内脏，去皮，制备下肢标本： 用粗剪刀在骶髂关节前1厘米处剪断脊柱，握住蟾蜍下肢，沿躯干两侧（避开坐骨神经）剪开腹壁。此时躯干上部及内脏即全部下垂。剪除全部躯干及内脏组织。剪去肛周皮肤；用圆头镊子夹住脊柱，注意不要碰到坐骨神经，捏住皮肤边缘，逐步向下牵拉剥离皮肤。将全部皮肤剥除后，把标本置于盛有任氏液的培养皿中。 2.1.1.3洗净双手和用过的全部手术器械。
分离两下肢： 避开坐骨神经，用粗剪刀从背侧剪去骶骨，然后沿中线将脊柱剪成左右两半，再从耻骨联合中央剪开，将已分离的标本浸入盛有任氏液的`培养皿中。 2.1.1.5 取出一下肢，用蛙钉固定于蛙板上，固定时要注意，坐骨神经和腓肠肌朝上。先用玻璃分针沿脊柱侧游离坐骨神经腹腔部，然后循股二头肌和半膜肌之间的坐骨神经沟，纵向分离暴露坐骨神经之大腿部分直至腘窝，在分离过程中，把神经周围的结缔组织去除干净，并把神经的细小分支剪断，但要注意不要用金属器械碰触神经，也不要对神经过度牵拉。实验期间应不断滴加任氏液使神经保持湿润。
用玻璃分针游离腓肠肌，并在下面穿线，在跟腱处打结。在结扎线的下方剪断跟腱，在膝关节处把除腓肠肌外的小腿其他部分剪除。注意保持完整的腓肠肌。 2.1.1.7用棉线在靠近脊柱的位置结扎坐骨神经，并在结扎线的上方剪断神经，用眼科剪剪断坐骨神经的全部支。从腘窝处开始剪掉大腿所有的肉，尽量把股骨刮干净，在膝关节上至少1cm处剪去上段股骨。将标本浸入任氏剂的培养皿中。
实验装置与仪器连接：1.将标本股骨残端固定在肌槽上的小孔内；2.将结扎腓肠肌肌腱的棉线与张力换能器连接，调节棉线的松紧，要与桌面垂直；3.将神经置于肌槽的刺激电极上，用任氏剂保持标本湿润；4.刺激电极插入微机上的刺激输入孔；5.张力换能器与微机相应通道相连。
打开电脑，进入生物信号采集处理系统，在菜单栏选择“实验项目”--------》“神经肌肉”-------》“刺激强度与反应的关系实验模块”点击开始，调节刺激参数，使频率自动逐渐递增，串间隔为2.连续记录不同频率时的肌肉收缩曲线。
五．结果与分析
不同频率刺激对肌肉收缩的影响：串间隔为2,频率增量为1时的张力变化（如图）可见单收缩、不完全强直收缩、完全强直收缩。
分析：刺激强度到达阈刺激时腓肠肌开始收缩，在最大刺激收缩力前随刺激强度增大而增大，到达最大刺激强度后，收缩力不发生明显改变；在最大刺激强度条件下，某较小频率使腓肠肌发生单收缩(如图中第一次刺激)，频率增大到，单收缩变为不完全强直收缩（如图中第2-6次刺激），频率继续增大，不完全强直收缩变为完全强制收缩（如图中第7、8次刺激）。不同的腓肠肌其阈刺激，最大刺激均存在差异；其单收缩，不完全强直收缩和完全强直收缩所要频率也不尽相同。
六．实验总结
本次试验严格按照操作步骤进行，所得实验结果较为理想，很容易观察到腓肠肌的单收缩、不完全强直收缩、完全强直收缩现象。在实验的过程中，制备坐骨神经-腓肠肌标本是最繁琐的步骤，也是实验成功的关键所在，期间，我们进行的比较缓慢，生怕弄错了哪一步，一步步想原理、回忆老师是怎么说的，所幸的是我们最终成功了，得到了较好的结果，在这次的不断尝试和思考中，很好地锻炼了我们的动手能力和思维能力。
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